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Sep 30, 2023

Las proteínas anticongelantes helicoidales de poliprolina tipo II están muy extendidas en Collembola y probablemente se originaron hace más de 400 millones de años en el Período Ordovícico.

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8880 (2023) Citar este artículo

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Las proteínas anticongelantes (AFP) se unen a los cristales de hielo para evitar que los organismos se congelen. Se ha encontrado una diversidad de pliegues AFP en peces e insectos, incluidas hélices alfa, proteínas globulares y varios solenoides beta diferentes. Pero la variedad de AFP en artrópodos no voladores, como Collembola, aún no se ha evaluado adecuadamente. Aquí, se demostró que la actividad anticongelante estaba presente en 18 de las 22 especies de Collembola de zonas frías o templadas. Se utilizaron varios métodos para caracterizar estas AFP, incluido el aislamiento mediante purificación por afinidad con hielo, espectrometría de masas MALDI, análisis de composición de aminoácidos, secuenciación por espectrometría de masas en tándem, secuenciación de transcriptomas e investigaciones bioinformáticas de bases de datos de secuencias. Todas estas AFP tenían un alto contenido de glicina y se predijo que tenían el mismo pliegue helicoidal de poliprolina tipo II, un pliegue exclusivo de Collembola. Estos hexápodos surgieron en el Período Ordovícico con los dos órdenes que se sabe que producen AFP divergiendo hace unos 400 millones de años durante la Edad de Hielo Andino-Sahariana. Por lo tanto, es probable que las AFP surgieran entonces y persistieran en muchos linajes durante las dos glaciaciones siguientes y los períodos cálidos intermedios, a diferencia de las AFP de los peces que surgieron de forma independiente durante la glaciación del Cenozoico que comenzó hace unos 30 millones de años.

Los organismos que viven en ambientes bajo cero deben adaptarse para evitar daños celulares debido a la congelación. La formación de cristales de hielo dentro de los tejidos vivos plantea el riesgo de deshidratación celular y la ruptura de las membranas celulares, lo que lleva a la muerte1. Los organismos que ocupan nichos que experimentan temperaturas bajo cero a menudo producen proteínas anticongelantes (AFP), que funcionan adhiriéndose y evitando el crecimiento de cristales de hielo2. Una vez unido, el crecimiento del hielo se limita a las áreas alrededor de la AFP, lo que provoca la formación de microcurvaturas en la superficie del hielo3,4. Esto hace que sea energéticamente desfavorable que el agua se una a la red de hielo, lo que da como resultado una depresión de la temperatura de congelación por debajo de la temperatura de fusión, lo que se denomina histéresis térmica (TH) y se utiliza para cuantificar la potencia de una AFP.

La primera AFP caracterizada fue de un pez teleósteo5. Desde entonces, se han observado AFP en otros peces6, insectos7,8 y microorganismos9,10,11. En los peces, se cree que las AFP surgieron durante la era Cenozoica que comenzó hace 20 a 40 millones de años, cuando el hielo marino en los polos estuvo presente por primera vez en ~ 200 millones de años12,13. En el agua de mar, la alta concentración de NaCl (~ 0,45 M) reduce la temperatura de congelación del agua de mar a ~ − 1,9 °C. Dado que la sangre de pescado tiene una concentración de soluto más baja y se congela a ~ − 0,8 °C, cualquier contacto con los cristales de hielo podría congelar el núcleo y matar a los peces5. En consecuencia, las AFP de pescado deben producirse en cantidades adecuadas y con suficiente actividad para disminuir la temperatura de congelación corporal en al menos 1,1 °C. Esto proporciona una ventaja selectiva a estos peces, ya que pueden buscar alimento de forma segura en mares cargados de hielo donde los peces que carecen de AFP corren el riesgo de congelarse. Se han encontrado cuatro tipos de AFP en el pescado: (1) AFP tipo I rica en alanina, (2) AFP tipo II similar a la lectina, (3) AFP tipo III derivada de la ácido siálico sintasa y (4) glicoproteínas anticongelantes ( AFGP). Con diferentes pliegues que realizan todos la misma función, surge la pregunta de cómo surgieron estas AFP por primera vez14.

Las AFP alfa-helicoidales de tipo I ricas en alanina han evolucionado de forma independiente en al menos cuatro ocasiones15. Los AFGP repetitivos simples han surgido en dos ocasiones independientes, una de ellas a partir de un gen de tripsinógeno por duplicación y divergencia16. Las AFP de tipo II han evolucionado a partir de un progenitor de lectina de tipo C y se han propagado a al menos dos ramas taxonómicas distantes de peces mediante transferencia lateral de genes17,18. La duplicación y divergencia de un gen de ácido siálico sintasa ha dado lugar a la familia de genes AFP tipo III, que solo se ha encontrado en una rama de peces19. Se cree que estos pliegues de AFP de peces han surgido en las últimas decenas de millones de años en respuesta a la glaciación polar20. En otras ramas de organismos como insectos21,22 y microorganismos23,24 también hay ejemplos en los que han surgido de forma independiente diferentes pliegues de AFP para realizar la misma tarea.

Los colémbolos son los artrópodos terrestres más abundantes y se encuentran en todos los continentes25. Estos pequeños organismos (la mayoría suelen tener solo unos pocos milímetros de largo) suelen vivir en el suelo, pero algunas especies viven en los árboles, en estanques o superficies húmedas que rodean las piedras, o en los glaciares. Collembola obtuvo su nombre de un órgano abdominal, el colóforo, que está involucrado en la regulación de iones y osmo26. Una segunda característica anatómica abdominal definitoria es un órgano cargado por resorte conocido como furca, que les permite escapar de los depredadores "saltando". Esto les ha dado su apodo de "colémbolos". Estos organismos primitivos surgieron hace unos 450 millones de años y existen cerca de 10.000 especies clasificadas hasta la fecha27. Aquellos que viven en ambientes bajo cero tienen mecanismos de tolerancia al frío para sobrevivir en estas duras condiciones, uno de los cuales es la producción de AFP. Previamente, se ha encontrado que algunas especies de Collembola tienen actividad TH28,29,30,31, resistencia al frío y capacidad de superenfriamiento32, pero hasta la fecha no se ha realizado ningún estudio sistemático de los tipos de AFP presentes y su distribución en Collembola.

La primera AFP colémbolo caracterizada fue la isoforma pequeña de 6,5 kDa de Hypogastrura harveyi (HhAFP)29. Se predijo que HhAFP tendría un pliegue helicoidal de poliprolina tipo II (PPII) rica en glicina33, una estructura que luego se confirmó mediante cristalografía de rayos X34,35. Este pliegue, que parece exclusivo de Collembola, consta de dos capas de hélices PPII antiparalelas conectadas por regiones de bucle. Cada rotación alrededor de la hélice tiene exactamente tres residuos de longitud con repeticiones tripeptídicas de G-X1-X2, donde X1 suele ser glicina. El núcleo de la proteína contiene los residuos de glicina que miran hacia adentro, lo que permite un empaquetamiento apretado debido a la ausencia de cadenas laterales33. El empaquetamiento compacto de las hélices permite que se desarrolle una red de enlaces de hidrógeno entre los esqueletos de las hélices que aumenta la estabilidad del pliegue36. Las dos capas tienen ambas una cara puntiaguda hacia afuera. Una superficie es plana, contiene pequeños residuos hidrófobos y se cree que funciona como superficie de unión al hielo (IBS)37. Esta superficie es rica en alanina, pero también contiene residuos de serina, treonina y valina. La superficie opuesta es irregular y contiene residuos más grandes, algunos de los cuales son polares o cargados. H. harveyi también produce una isoforma AFP de 15,6 kDa más grande que se propone que tenga 13 hélices de poliprolina38.

Un homólogo putativo de HhAFP se caracterizó recientemente a partir de Megaphorura arctica (MaAFP) recolectada en Islandia31. Aunque MaAFP de 6,5 kDa comparte grandes similitudes en la secuencia de codificación con HhAFP, sus regiones no traducidas (UTR) son divergentes hasta el punto de que no se pudo establecer definitivamente un ancestro común. Además, se estudiaron isoformas de AFP de 9,6 kDa de Granisotoma rainieri (GrAFP)39. La estructura de GrAFP se modeló para ser un paquete de poliprolina tipo II con nueve hélices, lo que se confirmó mediante cristalografía de rayos X. Cuando se compararon los UTR de los cinco ADNc de GrAFP, los más diferentes compartían solo el 69 % de identidad de secuencia. Por lo tanto, la falta de similitud entre las UTR de diferentes especies no desmiente la homología.

Aquí hemos caracterizado las AFP de 18 especies de Collembola de numerosas familias dentro de dos de las cuatro órdenes existentes de Collembola, recolectadas en cuatro continentes diferentes. La extensión del análisis estuvo determinada por la cantidad de biomasa disponible. Se usaron pequeñas cantidades de colémbolos (< 100 mg de tejido liofilizado) para determinar la actividad de TH y la formación de hielo. Las AFP se purificaron a partir de muestras más grandes (> 100 mg de tejido liofilizado) mediante purificación por afinidad con hielo (IAP) y se caracterizaron mediante MALDI-MS, composición de aminoácidos o espectrometría de masas en tándem. Se generaron transcriptomas a partir de algunas especies para deducir secuencias de AFP a nivel de ácido nucleico y, en algunos casos, para expresar de forma recombinante las proteínas codificadas. Las AFP presentes en los diferentes Collembola probados aquí inhibieron el crecimiento de hielo en el plano basal, lo que sugiere que podrían ser hiperactivos. Donde fue posible un análisis más detallado, todas las AFP examinadas tenían el mismo patrón repetitivo de tripéptido rico en glicina indicativo del haz helicoidal de PPII. Hasta la fecha, este pliegue solo se ha encontrado en Collembola y su presencia en especies distantes sugiere que el pliegue del haz helicoidal PPII se originó en una especie colémbolo basal, poco después de que surgiera el grupo.

Aquí, se analizaron 20 nuevas especies que representan cinco familias para TH (Tabla complementaria 1). La mayoría de las especies fueron recolectadas en el campo por los autores, mientras que algunas se obtuvieron de cultivos de otros laboratorios. Los colémbolos se mantuvieron típicamente durante varios años en placas de Petri con yeso de París húmedo mezclado con carbón, y se alimentaron ad libitum con levadura seca de panadería y/o algas verdes. Todas las especies se mantuvieron a 20 °C con 12 h de luz y 12 h de oscuridad. Las excepciones a este procedimiento fueron M. arctica y Entomobrya nivalis, que se recolectaron en el campo y se aclimataron en frío en el laboratorio (Tabla complementaria 1), y Cryptopygus antarcticus que se congelaron inmediatamente después de recolectarse en el campo. H. harveyi29 y G. rainieri39, que completaron el grupo de estudio de 22 especies, se recolectaron como se describió anteriormente.

Para inducir la síntesis de AFP, las muestras se aclimataron en la oscuridad y en frío a 10 °C durante 19 días, seguido de 5 °C durante 13 días y 1,5 °C durante 28 días. A continuación, los animales se liofilizaron durante 2 días. Los animales secos se añadieron 1:8 (proporción p/v) al tampón (Tris-HCl 50 mM (pH 7,8), NaCl 150 mM, feniltiocarbamida 1 mM y 1 × cóctel inhibidor de la proteasa de Roche sin EDTA) y se homogeneizaron a mano utilizando un mortero de plástico desechable en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Todas las manipulaciones y el almacenamiento temporal de las muestras se realizaron en hielo oa 4 °C para evitar la desnaturalización térmica de la AFP. Los homogeneizados se centrifugaron a 16 300 xg durante 30 min a 4 °C. La fracción acuosa debajo de la capa lipídica se eliminó para las mediciones de TH.

Las extracciones de AFP para la caracterización de proteínas se realizaron utilizando > 100 mg de animales liofilizados. Las muestras de tejido se homogeneizaron en tampón (Tris-HCl 50 mM (pH 7,8), NaCl 150 mM, feniltiocarbamida 1 mM y 1 × cóctel inhibidor de la proteasa Roche sin EDTA) utilizando un dispersor IKA ULTRA-TURRAX (Staufen, Alemania). El homogeneizado se centrifugó a 22.000 xg durante 30 min y el sobrenadante se filtró a través de lana de vidrio para eliminar los lípidos. Las AFP en el sobrenadante filtrado se recuperaron usando cuatro rondas de purificación con capa de hielo como se describió anteriormente40. La fracción de hielo final para cada preparación se concentró a < 500 µL utilizando un filtro AmiconUltracel 3 K (MilliporeSigma, Burlington, MA, EE. UU.) girado en una centrífuga Sorvall ST16R a 3000 × g.

Las composiciones de aminoácidos se determinaron en el SickKids Proteomics, Analytics, Robotics & Chemical Biology Center (SPARC, The Hospital for Sick Children, Toronto, ON, Canadá) mediante hidrólisis ácida como se describió anteriormente40 y también se usaron para calcular la concentración de proteína.

MALDI-TOF MS se realizó en Protein Function Discovery Facility (Queen's University, Kingston, ON, Canadá) utilizando una matriz de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico en gotitas secas con un SCIEX Voyager DE Pro en modo lineal. La secuenciación de proteínas por espectrometría de masas en tándem se realizó en el Centro de Proteómica, Análisis, Robótica y Biología Química SickKids (SPARC, The Hospital for Sick Children, Toronto, ON, Canadá).

Las muestras de ARN se extrajeron de 30 a 50 mg de tejido almacenado en RNAlater (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.). La extracción se realizó como se describió previamente39. El transcriptoma de C. antarcticus fue ensamblado en el Centro de Secuenciación y Genotipado (Universidad de Delaware, Newark, DE, EUA), y los de G. rainieri y E. nivalis fueron ensamblados en el Instituto de Ciencias del Genoma (Universidad de Maryland, Baltimore , MD, EE. UU.).

Las muestras que contenían AFP se inyectaron en una rejilla llena de aceite de inmersión en una unidad Peltier. La temperatura se controló utilizando un osmómetro de nanolitros (Micro-Ice Ltd, Alon Shvut, Israel) y un controlador de temperatura modelo 3040 (Newport, Irvine, CA, EE. UU.). Las muestras se congelaron instantáneamente y se fundieron lentamente hasta que quedó un único cristal de hielo. La temperatura se mantuvo justo por debajo del punto de fusión y luego disminuyó a una velocidad de 0,075 °C/min hasta que comenzó el crecimiento de hielo. Los videos de los cristales de hielo durante las mediciones de TH se grabaron con una cámara CCTV Panasonic WV-BL200 o una cámara industrial monocromática DMK 33UX249 USB 3.0 (The Imaging Source, Charlotte, NC, EE. UU.).

Los genes sintéticos optimizados por codones para G. rainieri (QQY00623.1) y Folsomia candida (OXA44825.1) AFP se solicitaron a GeneArt (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.). Se eliminó el ADN que codificaba el péptido señal y se codificó un residuo de metionina N-terminal para ayudar a introducir un sitio de corte NdeI. En el extremo C, se introdujeron codones de leucina y glutamato para añadir un sitio de corte XhoI. Los genes se subclonaron en vectores pET-24a39. Los plásmidos resultantes se transformaron en células competentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) para su aislamiento utilizando un kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.). Los ADN se verificaron en secuencia antes de que los plásmidos se retransformaran en células de expresión BL21 (DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Los cultivos celulares se cultivaron en medio de caldo de lisogenia con 100 µg/ml de kanamicina a 37 °C. Al alcanzar una DO600 de 0,6 a 0,8, los cultivos celulares se enfriaron a 20 °C y se añadió isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido 1 mM para inducir el cultivo celular durante la noche. Las células se centrifugaron a 4500 × g durante 30 min y se resuspendieron en 50 ml de tampón de lisis (Tris/HCl 20 mM (pH 7,8), NaCl 500 mM, imidazol 5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,1 mM y una tableta disuelta de cOmplete™ ultra cóctel de inhibidores de proteasa). Las células se sonicaron 16 veces a 10 s por ronda y se enfriaron a 4 °C entre ciclos para evitar la desnaturalización de las proteínas.

Las AFP recombinantes marcadas con His se separaron del sobrenadante del lisado mediante cromatografía de afinidad con Ni. Las fracciones que contenían AFP se agruparon, se cargaron en un matraz de fondo redondo de 250 ml sembrado con una cubierta de hielo y se purificaron por afinidad con hielo39.

Los identificadores de taxonomía para cada especie se extrajeron de la base de datos de taxonomía del NCBI. El árbol filogenético se ensambló usando phyloT (https://phylot.biobyte.de/).

Se evaluó la actividad de TH y la formación de cristales de hielo en sobrenadantes homogeneizados completos de 22 especies diferentes de Collembola (Fig. 1). De las 22 especies probadas, 18 tenían actividad TH. Los cristales de hielo individuales monitoreados en homogeneizados activos se derritieron en formas oblongas definidas que eran simétricas alrededor del eje c, lo que sugiere que las AFP se unen y estabilizan varios planos de hielo, incluido el plano basal. Por el contrario, los cristales formados en presencia de una AFP que no se une al plano basal, a saber, la AFP tipo I, se derriten en discos que crecen hasta convertirse en bipirámides hexagonales a medida que se enfrían (Fig. 1, paneles superiores izquierdos). Cuando se superó el punto de congelación en las muestras de colémbolos, el crecimiento de hielo dendrítico emanó de los ejes a y creció rápidamente en las muestras que tenían una alta actividad de TH. En Hypogastrura viatica y M. arctica, el estallido dendrítico cubrió el campo de visión dentro de un marco (1/12 s). Por el contrario, los cristales de hielo en el control del tampón tenían forma de disco y seguían creciendo con la misma forma, mientras que el estallido con AFP tipo I se producía a lo largo del eje c (Fig. 1, paneles superiores a la derecha). Las muestras se homogeneizaron en las mismas proporciones p/v, lo que hizo posibles las comparaciones de la actividad relativa de TH, y la actividad en diferentes especies osciló entre 0,2 y 1,7 °C. Estas diferencias podrían surgir de la variación en el número de copias del gen, los niveles de expresión y/o la actividad de las AFP.

Comparación de formación de hielo en homogeneizados colémbolanos. Los colémbolos liofilizados se homogeneizaron suavemente en tampón (8:1 v/p) y se analizó la actividad anticongelante (TH) de los sobrenadantes. Para cada especie (columna izquierda), se capturó una imagen del video durante la medición de TH (columna central) y justo cuando se superó el punto de congelación (columna derecha). El control positivo es AFP tipo I de lenguado de invierno (Pseudopleuronectes americanus). El control negativo es un tampón (Tris-HCl 50 mM (pH 7,8), NaCl 150 mM, feniltiocarbamida 1 mM y 1 cóctel inhibidor de la proteasa Roche sin EDTA).

El análisis del plano de hielo fluorescente de la gran isoforma AFP de H. harveyi mostró la unión a los planos basal y prismático del hielo38. La estructura cristalina de rayos X de GrAFP también proporcionó soporte para la unión del plano basal, ya que las aguas cristalográficas podían alinearse con los planos del prisma primario y basal del hielo39. Además, la alta actividad (> 2 °C) de dos de los homogeneizados sugiere que, al igual que en otros artrópodos como Tenebrio molitor41, la mayoría de los colémbolos producen AFP hiperactivas. Además, las diferencias constantes en la formación del hielo y el estallido entre las AFP colémbolanas y la AFP tipo I de la platija de invierno (Fig. 1) probablemente se deban a la unión del plano basal de las AFP colémboloas.

Las composiciones de aminoácidos de las AFP extraídas de tres especies de Collembola (H. harveyi, G. rainieri y M. arctica) se informaron previamente29,31,39. Aquí, los extractos de AFP de tres especies adicionales (Cryptopygus antarcticus, Folsomia candida y Protaphorura pseudovanderdrifti) también se sometieron a análisis de aminoácidos (Tabla complementaria 2). Todos tenían altas abundancias de glicina y alanina, que son diagnósticos del pliegue del haz helicoidal PPII. Sin embargo, estas proporciones de glicina y alanina fueron más bajas que las de H. harveyi, que se había purificado aún más, lo que sugiere cierta contaminación por niveles de trazas de otras proteínas. Esto es de esperar ya que cada ronda de IAP solo reduce los niveles de proteína no AFP ~ 10 veces40. Sin embargo, MALDI-MS sugirió que las AFP eran las especies dominantes después de IAP (Fig. 2). Los extractos de P. pseudovanderdrifti (Fig. 2A), C. antarcticus (Fig. 2B) y Ceratophysella denticulata (Fig. 2C) mostraron algunos picos discretos, correspondientes a dos o más isoformas pequeñas (5.9–8.8 kDa) y uno o isoformas más grandes (15,5–17,5 kDa), similar a lo informado previamente para M. arctica (Fig. 2D)31 y H. harveyi (6,5 y 15,7 kDa)29. En contraste, F. candida tiene un pico principal que consta de cuatro subpicos que difieren en ~ 16 Da (Fig. 2E) y G. rainieri (Fig. 2F)39 tiene tres grupos de isoformas dentro de un rango más estrecho de 6.9–12.2 kDa. También parece haber pequeñas variaciones en las isoformas, como lo indican los picos de los hombros. Al igual que las cinco isoformas de 9,6 kDa de G. rainieri39, es probable que haya isoformas dentro de cada población con algunos polimorfismos de aminoácidos.

Espectros MALDI de extractos purificados de colémbolo AFP. Las proteínas de: (A) Protaphorura pseudovanderdrifti, (B) Cryptopygus antarcticus, (C) Ceratophysella denticulata, (D) Megaphorura arctica, (E) Folsomia candida y (F) Granisotoma rainieri se purificaron con cuatro rondas de purificación por afinidad con hielo y sometidos a MALDI-MS. Las masas máximas principales están etiquetadas.

La secuenciación parcial de las AFP purificadas mediante espectrometría de masas en tándem de fragmentos trípticos proporciona un vínculo sólido entre las proteínas aisladas y sus secuencias de ácido nucleico. Esto ha ayudado previamente a deducir secuencias completas de AFP de M. arctica y G. rainieri a partir de datos transcriptómicos31,39. En este estudio, los fragmentos trípticos de las AFP de C. antarcticus y F. candida también eran ricos en glicina y alanina y contenían motivos repetidos GXX (Tabla 1).

Hay más de 3400 EST de C. antarcticus, de dos estudios42,43, en la base de datos del NCBI. Las búsquedas BLAST identificaron dos con secuencias de codificación completas (GR869204.1 y FF279148.1) y dos con secuencias de codificación incompletas (GR870234.1 y FF278983.1). Los transcritos completos codificaron una proteína de 108 aminoácidos (8,5 kDa) después de la eliminación del péptido señal de 19 aminoácidos (Fig. 3A). A GR870234.1 le faltaba el codón de inicio de metionina N-terminal y FF278983.1 tenía un extremo C truncado en el residuo 86. Se observaron picos con masas similares en el perfil MALDI (Fig. 2B). Se identificaron isoformas adicionales dentro del transcriptoma generado en este estudio; tres que codifican isoformas de 8,5 kDa (OQ445583, OQ445586 y OQ445587) y ocho que codifican isoformas de 15 kDa (OQ445584, OQ445585, OQ445588, OQ445589, OQ445590, OQ445591, OQ445592 , OQ445593). Las isoformas de 8,5 kDa tenían entre un 91 y un 93 % de identidad de secuencia a nivel de nucleótidos y proteínas (Fig. 3A). Usando un esquema para visualizar cada hélice, las isoformas de 8,5 kDa se pueden modelar para tener 6 hélices (Fig. 3B). Las cadenas de 3–4 motivos repetidos GX1X2 se pueden separar en hélices individuales separadas por regiones de bucle variable que tienen una longitud de 3–6 residuos de aminoácidos. Los residuos X2 en una hélice y la siguiente hélice alternan entre un residuo hidrofóbico e hidrofílico, y esto produce el sitio distintivo de unión al hielo (Fig. 3 superficies azules) y el sitio sin unión al hielo (Fig. 3 superficies rojas). Las isoformas de 15 kDa se agruparon en tres grupos. El primer grupo tenía tres isoformas con un péptido señal de 20 aminoácidos y una proteína madura de 192 aminoácidos (Fig. 4A). CaAFPb-4 tenía una deleción de cuatro aminoácidos, lo que hacía que la proteína madura tuviera 188 aminoácidos de longitud. El segundo grupo tenía tres isoformas con un péptido señal de 19 aminoácidos y una proteína madura de 192 aminoácidos (Fig. 4B). El tercer tipo tenía una sola isoforma (CaAFPb-8) con un péptido señal de 19 aminoácidos y una proteína madura de 187 aminoácidos (Fig. 4C). Dentro del primer y segundo grupo, las isoformas mostraron entre 88–99 % y 98–99 % de identidad de secuencia, respectivamente, mientras que entre estos grupos y el tercer tipo de isoforma solo hubo 50–52 % de identidad de secuencia. Dentro de cada grupo, las secuencias de aminoácidos en el bucle y las regiones que no son del SII estaban menos conservadas entre las isoformas. Cuando se comparan los tres grupos de CaAFP de 15 kDa, el número de hélices PPII fue constante, con 11 predichas (Fig. 4), y la longitud de cada hélice fue aproximadamente equivalente, con tres o cuatro repeticiones GXX o GGX cada una. Además, el número de enlaces disulfuro previsto varió, de 2 a 4. Las masas medias previstas de CaAFPb-8 (15,2 kDa) y CaAFPb-6 (15,5 kDa) coinciden estrechamente con los picos de 15.158 y 15.463 Da vistos por MALDI (Fig. 2B).

Alineación de secuencias de las isoformas de CaAFP de 8,5 kDa. (A) Se alinearon las secuencias de aminoácidos de las isoformas CaAFP de las tecnologías ecológicamente racionales y el transcriptoma generado. Los residuos de aminoácidos idénticos se resaltan en gris. Los residuos de glicina son de color azul. Los residuos de cisteína están coloreados en rojo y resaltados en amarillo. Los péptidos señal se muestran en minúsculas y la secuencia codificante se muestra en mayúsculas. Los rectángulos a continuación muestran hélices PPII supuestas para las caras IBS (azul) y no IBS (roja). CaAFPa-1, OQ445586; CaAFPa-2, GR870234; CaAFPa-3, OQ445587; CaAFPa-4, FF279148; CaAFPa-5, OQ445583; CaAFPa-6, GR869204; CaAFPa-7, FF278983. (B) Esquema de seis haces helicoidales de poliprolina tipo II. Las hélices antiparalelas están conectadas por regiones de bucle (no mostradas) y dispuestas en dos capas. Se muestran la superficie que se une al hielo (azul) y la superficie que no se une al hielo (roja). El enlace de hidrógeno entre las hélices estabiliza el pliegue.

Alineación de secuencias de las isoformas CaAFP de 15 kDa. Las secuencias de aminoácidos de las isoformas de CaAFP del transcriptoma generado se alinearon para los grupos (A) primero y (B) segundo. (C) La tercera isoforma de CaAFP (CaAFPb-8) está alineada con una secuencia del primer grupo (CaAFPb-3) y el segundo grupo (CaAFPb-6). La coloración es la misma que en la Fig. 3. CaAFPb-1, OQ445590; CaAFPb-2, OQ445584; CaAFPb-3, OQ445585; CaAFPb-4, OQ445589; CaAFPb-5, OQ445588; CaAFPb-6, OQ445592; CaAFPb-7, OQ445593; CaAFPb-8, OQ445591.

Se encontró que el ensamblaje anotado del genoma de F. candida44 contenía un solo gen que codifica una secuencia rica en glicina (OXA44825.1), denominada aquí FcAFP, que se asemeja a otras AFP helicoidales PPII. FcAFP comparte 57% de identidad de secuencia con GrAFP-4 (Fig. 5A). Se predijo que FcAFP tendría una estructura muy similar a la de GrAFP-4 resuelta por cristalografía39, con nueve hélices PPII formando una cara de unión al hielo formada por cuatro hélices pares.

Esquemas de haces helicoidales de poliprolina tipo II. Las secuencias de proteínas de FcAFP y CcAFP se organizaron en hélices de poliprolina individuales. (A) FcAFP se puede organizar en 9 hélices y (B) CcAFP se puede organizar en 12 hélices El color es el mismo que en la Fig. 3.

Los fragmentos trípticos analizados por espectrometría de masas en tándem (Tabla 1) respaldan la afirmación de que F. candida, a diferencia de las otras especies examinadas, tiene solo una isoforma de AFP. Los espectros dominantes coincidieron con los tres fragmentos trípticos predichos, y se secuenciaron varias veces, en la mayor parte de su longitud. Como el genoma44 y esta muestra (Tabla complementaria 1) se derivaron de la misma cepa partenogenética de laboratorio, esta coincidencia exacta no fue inesperada. Fragmentos similares de diferentes masas surgieron a partir de la fragmentación en la fuente del fragmento tríptico45 oa través de una modificación postraduccional. Los fragmentos eran a veces 16 Da más pesados ​​de lo esperado, y la masa adicional coincidía con los residuos de prolina seguidos de los residuos de glicina (Tabla 1, en negrita).

La secuencia de genes y las secuencias de fragmentos trípticos coincidían con las masas observadas por MALDI-MS. El pico dominante estaba en 9646 m/z, con las especies de doble carga en 4832 m/z, pero un examen detallado del espectro (Fig. 2E, recuadro) revela cuatro picos que difieren en ~ 16 Da. El más ligero, a 9632 m/z, se acerca mucho a la masa media de 9630 Da predicha para la proteína madura sin modificaciones, mientras que los otros a 9464, 9663 y 9679 probablemente contienen 1, 2 o 3 prolina modificada, respectivamente. Un aumento de masa de 16 Da es consistente con la hidroxilación de prolina. El colágeno contiene repeticiones X1-X2-G y la estructura consta de tres hélices PPII en paralelo que forman la triple hélice del colágeno46. La prolina se modifica a hidroxiprolina dentro de los motivos XPG en todo el documento47. Por lo tanto, es probable que el mismo proceso sea el responsable de modificar, en promedio, uno de los seis motivos XPG en la AFP, dado que la secuencia se repite y la estructura secundaria de las dos proteínas son similares.

La proteína extraída de F. candida tenía solo 0,2 °C de actividad TH en la concentración probada, más baja que la mayoría de las otras especies (Fig. 1). Cuando se expresó de forma recombinante en E. coli, FcAFP alcanzó 0,52 ± 0,01 °C de TH a una concentración de solo 2,3 μM. Esto sugiere que incluso después de la aclimatación al frío, los niveles de AFP producidos en el animal a partir de este único gen están muy por debajo de lo que se puede alcanzar in vitro. A pesar de producir una AFP, cuando F. candida se expuso a -3 °C durante 15 días, ninguno de los especímenes sobrevivió32. Sin embargo, cuando pasan hambre, su punto de sobreenfriamiento está por debajo de -15 °C48. Los artrópodos con alta actividad de TH generalmente tienen más de un gen de AFP, lo que produce diferentes isoformas de AFP, como lo ejemplifica la polilla del gusano de las yemas del abeto con sus 16 copias de genes49, y los otros colémbolos aquí descritos.

Anteriormente se sabía que Entomobrya nivalis tenía una actividad de TH de hasta 3,5 °C en su hemolinfa durante los meses de invierno50. Por lo tanto, el número limitado de animales que se recolectaron en el campo se aclimató antes de extraer su ARN. Se generó un transcriptoma a partir del cual se identificaron cinco isoformas de AFP (Fig. 1B complementaria). Cada secuencia tenía un péptido señal de entre 22 y 24 aminoácidos de longitud. Las proteínas maduras tenían masas previstas de 8,9 kDa, 9,6 kDa y 11,2 kDa. La isoforma de 8,9 kDa (EnAFP-2) era 86 % idéntica a la isoforma de 11,2 kDa (EnAFP-3) con una eliminación de 29 aminoácidos que probablemente elimina dos hélices. Las otras secuencias tenían entre 64 y 81% de identidad.

Usando las secuencias de otras AFP colémbolonas como una consulta BLAST, se encontró una secuencia que se asemeja a una AFP helicoidal PPII en el genoma de Ceratophysella communis (VNWX01004235.1) Se predijo que el gen contenía un único intrón51, y la lectura abierta resultante de 732 pb el marco codificó una AFP que se predijo que tenía un péptido señal de 23 aminoácidos52. La proteína madura tenía una longitud de 220 aminoácidos y se puede modelar para tener 12 hélices PPII (Fig. 5B). Aunque no se recolectó C. communis, sí se recolectó C. denticulata, y el homogeneizado tenía 0,7 °C de TH (Fig. 1). Además, el pico más grande en MALDI-MS tenía una masa de 17,5 kDa, similar a los 17,2 kDa previstos para la secuencia de AFP de C. communis madura.

Diez de las especies de colémbolos muestreadas eran de Poduromorpha y 12 de Entomobryomorpha (Fig. 6). Los diez poduromorfos y los ocho entomobriomorfos tenían actividad de AFP. Las cuatro especies que carecían de actividad de AFP pertenecían a la familia Entomobryidae, pero E. nivalis también estaba dentro de esta familia y tenía actividad de AFP. Otras catorce especies han sido analizadas para actividad TH por otros28,30,53, para un total de 11 de 11 poduromorfos y 15 de 25 entomobriomorfos que dieron positivo para actividad AFP. De las especies que no produjeron AFP, dos se encontraron nuevamente en Entomobryidae, así como cuatro en Isotomidae.

Árbol taxonómico de colémbolos productores de proteínas anticongelantes. Se generó un árbol taxonómico para las especies de los cuatro órdenes de Collembola (Entomobryomorpha, Poduromorpha, Symphypleona y Neelipleona) basado en la taxonomía NCBI. Las especies con y sin actividad TH están coloreadas en rojo y azul, respectivamente, y los grupos no probados están en negro. Las especies analizadas en este documento están en negrita y todas las demás especies que no están en negrita fueron analizadas por Zettel28, excepto Gomphiocephalus hodgsoni30 y Cryptopygus terranovus (syn. Gressittacantha terranova)53. Las especies con una estrella produjeron AFP ricas en glicina. Gomphiocephalus hodgsoni con un cuadrado rojo es una AFP rica en cistina e histidina propuesta30.

Se predijo que el haz helicoidal PPII rico en glicina sería el pliegue AFP de ocho especies de Collembola, que abarca cinco familias y dos órdenes. La presencia de AFP helicoidales PPII tanto en Entomobryomorpha como en Poduromorpha sugiere que esta familia de proteínas se originó antes de su divergencia (Fig. 7). La secuencia exacta de la diversificación taxonómica de los colémbolos todavía se está debatiendo. Los cuatro órdenes se pueden organizar en clados hermanos variados según los conjuntos de datos utilizados. Cuando se usaron secuencias 18S y 28S, Neelipleona fue basal a (Symphypleona + (Entomobryomorpha + Poduromorpha)54. Sin embargo, cuando se usaron secuencias 16S, 28S y cox1, las posiciones de Neelipleona y Symphypleona se invirtieron y Symphypleona fue basal55. Independientemente de la relación filogenética exacta , la datación mitocondrial sugiere que los cuatro órdenes divergieron entre hace 437 y 421 millones de años.56 Este período coincide con la glaciación andino-sahariana, una edad de hielo que duró desde hace 460 a 420 millones de años.57 Además, los linajes correspondientes a las familias existentes divergieron entre 414 y 184 millones de años 56, en el que se produjo la glaciación Karoo, entre 360 ​​y 255 millones de años 58. La diversificación y la necesidad de resistencia a la congelación en el mismo período de tiempo permitiría la radiación de las especies que expresan PPII AFP helicoidal.

La relación entre la filogenia colémbolo y las glaciaciones. Un árbol filogenético que muestra la línea de tiempo de la divergencia en Collembola. Los sombreados en verde, morado y amarillo muestran tiempos estimados para la divergencia de órdenes, familias y géneros/especies, respectivamente. El número de especies productoras de AFP se muestra debajo del nombre del pedido. La flecha roja indica la aparición de AFP de peces durante la era Cenozoica. Los icebergs muestran el lapso de tiempo de cada edad de hielo respectiva.

El momento de la diversificación en géneros podría haber llevado a que las especies carecieran de AFP. Dentro de la superfamilia Entomobryoidea, Sinella curviseta, Heteromurus nitidus, Lepidocyrtus violaceus y tres especies del género Orchesella no mostraron actividad anticongelante AFP, mientras que E. nivalis sí (Fig. 6). Los análisis de una muestra de Collembola de China estimaron que cinco clados polifiléticos del género Entomobrya se diversificaron hace entre 66 y 34 millones de años durante el máximo térmico del Paleoceno-Eoceno59. Durante este período, hace unos 55 millones de años, las temperaturas globales eran un promedio de 5 a 8 °C más altas que las actuales60. Se estima que Sinella se separó de un clado de Entomobrya hace unos 69 millones de años, mientras que Heteromurus y Orchesella se separaron de la familia Entomobryidae hace unos 100 millones de años59. El ancestro de la especie que carece de AFP en la superfamilia Entomobryoidea podría haber perdido su AFP durante este período, lo que provocó la radiación de especies sin un gen AFP, mientras que el linaje E. nivalis retuvo el suyo.

A diferencia de los peces teleósteos, donde las AFP no se originaron hasta la era Cenozoica (hace ~ 30 millones de años) después del máximo térmico del Paleoceno-Eoceno20, no hay signos de una diversificación repentina de las AFP colémbolos durante este evento o la glaciación anterior de Karoo. En teoría, ciertos linajes pueden haber perdido su(s) gen(es) de tipo PPII AFP durante un período interglacial, solo para desarrollar un reemplazo para hacer frente a una nueva edad de hielo. Por esta razón, vale la pena señalar la diferente composición de aminoácidos de una AFP previamente identificada en la especie colémbolo antártica, Gomphiocephalus hodgsoni30. Esta AFP contenía altos porcentajes de histidina y cistina que la diferenciaban de las AFP de tipo PPII (Tabla complementaria 2). Sin embargo, aún no se ha identificado la secuencia de esta AFP. Curiosamente, esta especie es miembro de la familia Hypogastruridae en la que dos especies (H. harveyi y C. communis) producen AFP helicoidales PPII ricas en glicina.

Los orígenes y la relación de las AFP de PPII son difíciles de determinar, ya que la naturaleza repetitiva de la proteína hace que las comparaciones entre especies relacionadas de forma lejana sean extremadamente difíciles. La homología no se puede inferir fácilmente a partir de secuencias repetitivas, especialmente cuando están bajo selección para actividad anticongelante. Por ejemplo, las AFP tipo I ricas en alanina de los peces, algunas de las cuales tienen residuos de treonina en intervalos de 11 aminoácidos, inicialmente parecían homólogas, pero ahora se sabe que han evolucionado a través de la convergencia en los últimos 30 millones de años15. Afortunadamente, el origen de las AFP platija tipo I se rastreó a través de sus UTR20. Es posible que la convergencia también jugara un papel en la evolución de las AFP colémbolos. Sin embargo, esto parece poco probable, ya que todas las especies examinadas hasta la fecha, excepto una, producen AFP ricas en glicina y las secuencias conocidas se forman34,39, o se pueden modelar (Figs. 3, 5)31,38 como haces helicoidales de PPII con una forma de hielo. cara vinculante. Por el contrario, cuando las AFP surgieron en insectos y peces teleósteos, se utilizó una variedad de pliegues de proteínas diferentes como AFP61,62,63,64,65. Además, la longitud de las hélices PPII no varía entre isoformas o especies. Cuando se agregó una repetición GGX adicional a cada hélice de GrAFP, la actividad de TH disminuyó, lo que sugiere que esto podría ser una presión selectiva para limitar la longitud de las hélices37.

Es poco probable que un análisis de las UTR de las AFP colémbolanas proporcione pistas sobre su origen. Muchas de las especies estudiadas aquí divergieron mucho antes que los peces teleósteos (Fig. 7). Esto ha proporcionado suficiente tiempo para que sus regiones no codificantes diverjan hasta el punto de ser irreconocibles como homólogas. Esto es evidente incluso cuando se comparan las UTR 5ʹ y 3ʹ entre transcritos de una sola especie. Por ejemplo, los 5ʹ- y 3ʹ-UTR de EnAFP tienen entre 65–93 % y 60–84 % de identidad de secuencia, respectivamente. La falta de identidad de secuencia no codificante se informó previamente entre HhAFP y MaAFP31, y entre las isoformas de HhAFP38 y GrAFP39. Esto sugiere que algunas de estas AFP PPII, incluso las de la misma especie, han estado divergiendo durante mucho más de 30 millones de años.

Una limitación de este estudio fue nuestra incapacidad para muestrear especies de Neelipleona o Symphypleona. Actualmente hay una subrepresentación de datos genómicos y transcriptómicos para estos órdenes en relación con Entomobryomorpha y Poduromorpha, pero nueve secuencias genómicas están disponibles públicamente en NCBI. Aunque no se encontraron AFP PPII en las ocho secuencias genómicas de Symphypleona y Neelipleona, cabe señalar que la naturaleza repetitiva de las AFP PPII, junto con la abundancia de genes ricos en glicina (como el colágeno), intrones y secuencias repetitivas repletas con potenciales codones de glicina, dificultan la identificación de los genes AFP. Por lo tanto, la identificación de estas AFP depende en gran medida de la extracción de tejido. Desafortunadamente, hasta donde sabemos, el cultivo de laboratorio de Symphypleona y Neelipleona es difícil, lo que complica los estudios detallados sobre las AFP en estos dos órdenes.

Los conjuntos de datos generados durante el estudio actual están disponibles en el depósito de GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) con los números de acceso OQ511494-98 y OQ445583-93.

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Agradecemos a David McLeod de las instalaciones de Protein Function Discovery en Queen's University por el análisis MALDI de AFP. Agradecemos a Marie Boddington por el análisis preliminar de Megaphorura arctica y Folsomia candida AFP, a David Denlinger por la colección de Cryptopygus antarcticus y a Matty Berg por la colección de Isotoma riparia. Este trabajo fue apoyado por CIHR Foundation Grant FRN 148422 a PLD y Det Frie Forskningsråd Grant 1026-00055B a MH. PLD ocupa la Cátedra de Investigación de Canadá en Ingeniería de Proteínas. Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación/análisis/interpretación de datos, la redacción del informe o el envío del artículo para su publicación.

Departamento de Ciencias Biomédicas y Moleculares, Queen's University, 18 Stuart Street, Kingston, ON, K7L3N6, Canadá

Connor L. Scholl, Laurie A. Graham y Peter L. Davies

Sección de Ecología Terrestre, Departamento de Ecociencia, Universidad de Aarhus, CF Møllers Allé 4, 8000, Aarhus C, Dinamarca

Martín Holmstrup

Centro de Investigación del Ártico, Universidad de Aarhus, Ny Munkegade 114, 8000, Aarhus C, Dinamarca

Martín Holmstrup

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Conceptualización, PLD, MH y LAG; metodología, todos los autores; investigación, CLS y LAG; recursos, PLD y MH; escritura: original, CLS, PLD y LAG; redacción—revisión y edición, todos los autores; visualización, CLS; adquisición de fondos, PLD y MH

Correspondencia a Peter L. Davies.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Scholl, CL, Holmstrup, M., Graham, LA y col. Las proteínas anticongelantes helicoidales de poliprolina tipo II están muy extendidas en Collembola y probablemente se originaron hace más de 400 millones de años en el Período Ordovícico. Informe científico 13, 8880 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35983-y

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Recibido: 31 de marzo de 2023

Aceptado: 26 de mayo de 2023

Publicado: 01 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35983-y

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